粪便菌群移植,放射性肠炎的一种有前途的治
陈按：放射性肠炎（RE）是腹部和骨盆放疗的常见并发症。它通常分为急性放射性肠炎（ARE）和慢性放射性肠炎（CRE）。放射性肠道损伤会导致肠道微生物菌群分布异常，这是国内首篇使用FMT(粪便菌群移植)在放射性肠炎患者身上的治疗案例研究报道，值得学习和思考。
背景：越来越多的证据表明，肠道菌群与辐射引起的肠道损伤密切相关。我们旨在评估粪便菌群移植（FMT）在慢性放射性肠炎（CRE）患者中的安全性和有效性。
方法：对CRE进行FMT的初步研究。主要结果是安全性和对FMT的反应，这被定义为粪便菌群移植8周后，放疗肿瘤学组（RTOG/EORTC）的晚期毒性等级较基线降低1级。次要结果包括CRE的四种常见症状（腹泻，直肠出血，腹/直肠疼痛和粪便失禁）的严重程度降低以及Karnofsky功能状态（KPS）评分的变化。通过16SrRNA测序进行微生物分析。
结果：年1月至11月，五名女性患者接受了FMT，中位年龄为58岁（45-81岁）。基线RTOG/EORTC的中位数为2（范围2-4）。3例患者对FMT有反应，腹泻，直肠出血，腹痛/直肠疼痛和大便失禁以及KPS评分降低均得到改善。没有发生与FMT相关的死亡和感染并发症。在8到18个月的随访期间观察到一种轻度的FMT相关的AE。16SrRNA测序表明FMT改变了患者肠道菌群的组成。
结论：本病例系列首次证明，FMT可以在一段时间内安全有效地改善CRE患者的肠道症状和粘膜损伤。
放射性肠炎（RE）是腹部和骨盆放疗的常见并发症。它通常分为急性放射性肠炎（ARE）和慢性放射性肠炎（CRE）。ARE在放疗的前三个月内出现（通常是自限性的）。在发生CRE时，可能是由于ARE的进展，或者是放疗完成3个月后发生的，潜伏期可能长达20年以上。主要症状包括直肠出血，绞痛，腹泻，大便失禁，肠梗阻和瘘管形成。CRE通常是进行性的，目前的治疗选择仍不理想[1]。因此，需要对CRE患者进行有效治疗的进一步研究。
越来越多的证据表明，辐射导致动物和人类肠道菌群的显着改变[2-5]。重要的是，与未患RE的患者相比，患有RE的患者表现出更大的微生物群变化[4,6–8]。Gerassy-Vainberg等[9]发现辐射引起的营养不良可能会增加肠道对RE和炎症的敏感性。这些发现表明，微生物群可能是RE过程的关键驱动力，并通过靶向肠道微生物群提供了预防或治疗RE的可能性[10]。粪便菌群移植（FMT）已被认为是治疗其他类型结肠炎的有效方法，包括艰难梭菌相关性结肠炎和炎症性肠病[11]。最近的一项研究表明，FMT可以减轻和预防小鼠的ARE[12]。另外，在一些临床研究中，益生菌已被证明对预防ARE有益[13-15]。然而，从未在患者中探索通过FMT调节肠道菌群以治疗CRE。这项初步研究旨在评估FMT在CRE中的安全性和有效性，并描述FMT后肠道菌群的变化。
材料和方法
患者和捐赠者
本研究于年1月至11月之间进行（NCT）。所有患者均在首次干预之前或之时接受了结肠镜检查以确认CRE的诊断。如果患者已怀孕或正在哺乳或被诊断出患有胃肠道感染，心肺功能衰竭，严重的肝脏或肾脏疾病，则将其排除在外。在FMT之前使用的稳定剂量的CRE维持药物允许作为伴随治疗。所有捐赠者均来自我们的通用粪便微生物库（中国的fmtBank）[16]。筛选最佳同种异体供体的独家方法最近更新为筛选的八个方面：年龄，生理学，病理学，心理学，准确性，时间，生活环境和接受者[16]。简而言之，所有患者均接受来自18-24岁的无关的万能捐献者的FMT。除了最初的资格筛选之外，还计划为这些捐赠者进行定期的安全监测，包括饮食指导，生活环境随访和实验室检查。筛选供体的详细标准在我们最近的FMT研究中进行了报道，该研究用于危重患者与抗生素相关的腹泻的抢救治疗[17]。
粪便菌群移植程序
将新鲜的粪便样品用无菌容器收集，并通过基于GenFMTer（FMTMedical，南京，中国）的自动纯化系统直接处理[16,18]。一种称为“一小时FMT方案”的方法，定义了从供体排便到富集细菌物质并在一小时内注入患者的肠道[16]。在本研究中，FMT的方法学最近被称为冲洗微生物菌群移植（WMT）[31]，这取决于实验室中的自动纯化系统和洗涤过程。在每次输注中，总共约mL悬浮液（包括约50cm3富集的粪便微生物群）通过鼻空肠经内镜下肠内输液管（TET）输送。最多可以治疗3次。在我们之前发布的FMT协议中显示了患者准备工作和FMT程序的详细信息[17,18]。
结果
主要结局是安全性和对FMT的反应，这被定义为FMT8周后，放疗肿瘤学组（RTOG/EORTC）晚期毒性等级[19]从基线水平降低1级（补充文件1：表S1））。根据美国国家癌症研究所的不良事件（CTCAE）5.0版本通用术语标准，不良事件（AE）分为轻度（1级），中度（2级），严重（3级），威胁生命（4级）和死亡（5级）。AE和FMT之间的相对性被分类为绝对相关，大概率相关，可能相关和不相关[20]。AE的因果关系由独立的数据安全监控委员会评估。在这项研究中仅报道了与FMT相关的（包括绝对，很可能和可能与之相关的）AE。次要结局包括通过CTCAE5.0版本（补充文件1：表S2）测量的CRE中四种症状（腹泻，直肠出血，腹痛/直肠疼痛和粪便失禁）的严重程度降低以及所评估患者的功能状态改变根据Karnofsky功能状态（KPS）评分[范围从0（死亡）到（正常活动，无疾病迹象）][21]。此外，Child–Pugh评分[范围从A级（5–6分，轻度）到C级（10–15分，重度）]用于确定病例5的肝硬化严重程度。
粪便样品收集和微生物群分析
从三名患者（病例1、2、3）基线，FMT后四周（病例2）和八周（病例1、2、3）进行收集粪便样品，通过16SrRNA测序（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）对微生物群进行分析，评估粪便的多样性和组成。还分析了来自其各自供体（供体1、2、3）的粪便悬浮液。由于距离太远，无法获得病例4和病例5的粪便样品，患者分别在FMT后两周接受了手术。粪便样本收集和16SrRNA测序方法的详细信息已在我们的近期报告中显示[22]。
结果
招募了5例患者。表1列出了患者的特征。中位年龄为58岁（45-81岁）。所有患者均为女性。所有患者均接受了41.8至50.4Gy的外放疗；案例1和案例2分别接受了18Gy和25Gy的近距离放射治疗。停止放疗与入组之间的中位时间为21（10-）个月。所有患者都有医疗史，但症状持续。随访时间为8到18个月。所有捐赠者均为21至24岁的大学生。
在这项研究中，没有观察到FMT引起的死亡和感染并发症。病例4发生1例轻度AE，后者在FMT之后立即经历短暂的恶心并在24h内自行消退。这肯定与FMT有关。
FMT后有3例患者（1、2和4例）达到了主要结局。临床过程和内窥镜或影像学变化如图1所示。FMT后八周，病例1根据症状和内窥镜外观表现出有利的改善（图1Ai，图1Bi-ii）。不使用药物时，她的RTOG/EORTC评分从2降至1。在基线时，病例2有严重的肠道症状。
（图1Aii）。结肠镜检查显示放疗引起的直肠结肠狭窄和深溃疡（补充文件2：图1）。3次FMT后8周，她的RTOG/EORTC评分从3改善到1（图1Aii）。但是，临床症状和重复的盆腔磁共振成像（MRI）提示在FMT后12周出现了直肠阴道瘘（补充文件3：图2）。有趣的是，她仍然保持肠道症状的缓解，而MRI结果表明，与基线相比，放射诱发的直肠水肿得到了明显缓解（图1Ci与图1Cii）。然后她成功地进行了结肠造口术。病例3对FMT无反应（图1iii，图1D）。在案例4中，RTOG/EORTC等级在FMT后8周从2降至1（图1iv）。病例5被诊断为CRE和肝性脑病（HE），基线时Child-Pugh得分为9（B级）（图1v）。FMT之前的腹部和盆腔MRI显示放射诱发的乙状结肠膀胱瘘（补充文件4：图3）。然后，根据我们作为FMT中心的临床经验，她通过胃镜进行了一次新鲜的FMT治疗，以考虑在随后的瘘管手术之前缓解肝性脑病(HE)并控制盆腔炎症。治疗后两周，她的Child-Pugh得分提高到6（A级）（补充文件1：表S3）。最后，她成功地从结肠造口术和瘘管修补的麻醉中恢复了。每位患者的详细临床过程显示在补充文件5：病例介绍。
表1患者特征，不良事件和反应。
案例1
案例2
案例3
案例4
案例5
年龄，年/性别
55/女
45/女
81/女
58/女
76/女
体重指数，kg/m2
23.9
21.6
21.9
21.6
24.7
癌症
子宫内膜癌
宫颈癌
宫颈癌
宫颈癌
宫颈癌
合并症
没有
SLE，高血压
高血压
高血压
乙状结肠瘘，HE，肝硬化，慢性丙型肝炎，贫血，2型糖尿病
辐射剂量，Gy/Fx
外照射疗法
46.8/26
41.8/22
50/25
45/25
50.4/28
近距离放射疗法
18/3
25/4
-
放疗停止和入组之间的间隔，月
16
10
23
21
CRE持续时间，月
8
2
7
48
6
FMT之前的治疗史
口服蒙脱石散，洛哌丁胺，中药和益生菌；地塞米松灌肠剂和中药灌肠剂；谷胱甘肽注射液
口服地塞米松，抗生素和益生菌；地塞米松灌肠剂和中药灌肠剂
地塞米松灌肠和中药灌肠
口服蒙脱石散和益生菌；中药灌肠
乙二胺注射液；口服止痛药和中药；输血和营养支持疗法
伴随治疗
没有
口服地塞米松5mg/d（FMT后第4周前无类固醇）;输血
没有
蒙脱石散
输血，补充白蛋白
基准RTOG/EORTC等级
2
3
2
2
4
基准KPS评分
70
20
70
70
20
FMT的频率/时间表
1/day1
3/day1，day11，day12
2/day1,day2
1/day1
1/day1
每个FMT的粪便微生物容量，cm3
50
50
50
50
50
捐赠者
捐助者1
捐助者2
捐助者3
捐助者4
捐助者5
传送路线
鼻空肠管
鼻空肠管
鼻空肠管
鼻空肠管
胃镜
疗效
反应
反应
无反应
反应
无反应
安全随访，数月
8
18
9
18
18
复发时间，周
12
12
0
28
0
与FMT相关的AE（等级）
无
无
无
短暂性恶心（1）
无
BMI，体重指数；SLE，系统性红斑狼疮；HE，肝性脑病；CRE，慢性放射性肠炎；FMT，粪便微生物群移植；RTOG/EORTC，放射治疗肿瘤学小组；KPS，卡诺夫斯基功能状态评分；AE，不良事件。
FMT的疗效评估是在最后一次输注后8周。
粪便菌群移植
图1.粪便菌群移植后患者的临床病程和内镜改变。（A）代表每个患者临床过程的时间表。FMT，粪便微生物群移植。RTOG/EORTC，放射治疗肿瘤学小组晚期毒性反应量表。腹泻，直肠出血，腹/直肠疼痛和大便失禁的严重程度通过《不良事件通用术语标准》（CTCAE）5.0版进行了评估。根据卡诺夫斯基功能状态（KPS）评分（从0[死亡]到[正常活动，无疾病迹象]）评估患者的功能状态。（Bi–ii）病例1（反应者）：黄色箭头指向FMT之前辐射诱发的溃疡性病变，以及FMT之后12周在同一区域由先前溃疡引起的疤痕。（Ci–ii）案例2（反应者）：与基线相比，FMT术后12周放射引起的直肠水肿得到缓解。（Di–ii）案例3（无反应者）：结肠镜检查显示辐射引起的大量毛细血管扩张和粘膜水肿；FMT后8周未观察到粘膜损伤的明显改善。（E）案例4（反应者）：（i）辐射诱发的结肠糜烂；（ii）结肠粘膜瘢痕形成。注意：病例5在FMT后2周接受了手术。因此，在病例5中未进行FMT后的重复结肠镜检查或MRI检查。
图2.通过16SrRNA测序分析患者和供体粪便微生物群。（A）对粪便微生物群的多样性进行了评估，该多样性由Shannon的多样性指数进行了量化，并评估了患者和FMT供体样品的总观测操作分类单位（OTU）数量。（B）FMT之前和之后的粪便微生物群的主坐标分析（PCoA）。样本之间的距离代表了微生物群组成的相似性。距离越近表明相似度越高。（C）按来源对来自（A）中的样品的微生物16S序列进行分类（对于患者基线是唯一的，对于供体是唯一的，在患者基线和供体中均存在，或者在患者基线和供体中均不存在）。（D）在纲水平分析粪便微生物群的组成。（E）前十大细菌属随时间丰度的变化。注意：由于私人原因和手术操作，分别未获得病例4和病例5的样本。
案例1、2、3中肠道菌群的多样性和组成如图2所示。FMT后患者的肠道菌群多样性有所增加，这是通过香农的多样性指数来衡量的（图2Ai–iii，左侧）。在FMT之后，观察到的操作分类单位（OTU）的数量增加了（图2Ai-iii，右）。未加权UniFrac距离的PCoA表明，FMT后患者的肠道菌群组成与各自的供体相似（图2B）。评价独特
在患者FMT前粪便样品和FMT材料中可检测到的16SrRNA序列唯一性的评估用于确定纵向样品中可能的细菌起源，表明供体来源微生物的部分丰度已通过FMT操作连接到各自患者的肠道微生物中（图2Ci-iii）。
在案例1（反应者）中，最初的微生物群组成以梭状芽胞杆菌为主，其次是伽玛变形杆菌（图2Di）。FMT后八周，出现了芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属显著的增长（图2Ei）。病例2（反应者）的微生物群组成以杆菌纲，拟杆菌纲，梭菌纲和负加维替斯菌纲为主（图2Dii）。FMT后八周，杆菌纲和负加维替斯菌纲的丰度下降，代替的是丹毒丝菌纲和红蝽菌纲增加。此外，FMT后出现了布劳特氏菌属（图2Eii）。此外，病例2在FMT后链球菌和拟杆菌属的丰度下降。在病例3（无反应者）中，微生物群组成在基线时以拟杆菌纲，梭菌纲和杆菌纲为主导（图2Diii）。FMT后八周，有益细菌，例如阿利斯皮氏菌，杆菌属，链球菌和拟杆菌属扩大，而费氏杆菌的丰度下降（图2Eiii）。肠道菌群的组成在补充文件6中有详细说明：图4。
讨论
本试点案例系列研究探讨了FMT在CRE中的安全性和有效性。总体而言，五名新招募的患者中有三名在FMT后达到了临床反应。目前的发现启发我们相信FMT在临床实践中的作用，特别是在艰难梭菌感染之外的疾病中。
在这项研究中，FMT可以改善直肠出血，大便失禁，腹泻以及腹部和直肠疼痛。在情况1、2和4中，肠道症状在短期内有所改善，但疗效并不持久。因此，患者可能需要重复进行FMT，而不是“一次性”治疗。CRE的伤害有时是进行性的。因此，应该建议在RE的早期而不是在严重的状态下进行FMT。
目前的结果表明，FMT在CRE中可能是一种安全且耐受良好的治疗方法。一种轻度和短暂的FMT相关的AE被报道。在这里，我们希望突出说明为什么我们最终对病例5进行了FMT的原因，其中有辐射诱发的乙状结肠膀胱瘘和出血相关的HE。后续手术中的麻醉可能是诱发HE患者严重并发症的危险因素。Child-Pugh评分为7的患者应禁忌腹部手术，因为术后死亡率较高[23]。根据有关FMT缓解HE疗效的最新报道[24]以及我们对FMT在难治性瘘管克罗恩病并发炎性肿块[25,26]的安全性的研究，我们讨论后最终没有排除案例5的FMT治疗，因为微生物治疗有潜在的好处。在这种情况下，FMT后两周，Child-Pugh分数从9（B级）降低到6（A级）。
尽管放疗会影响患者的肠道菌群，但RE中哪些特定的分类单元发生了改变尚不清楚，而且不同报告的结果也有所不同[4,6-8]。在这项研究中，CRE患者原始菌群组成的特征表明，在肠道营养不良，肠道炎症和辐射引起的肠损伤中常见的伽马变形菌纲，杆菌纲和负加维替斯菌纲增多[2,4,27,28]。病例2的微生物群组成表明FMT后布劳特氏菌属的扩张，这与减少肠道炎症和肠道菌群重新平衡的有益作用有关[29,30]。但是，三名患者中存在的细菌类群非常不同，在FMT之后未观察到微生物群组成变化的显著趋势。已经提出辐射可能不会影响单个生物，而是会广泛影响微生物群落[7]。
该试点案例系列研究存在局限性，包括队列规模小，无对照组和对CRE亚组的进一步分析。尽管招募前对传统治疗无效的患者受益于FMT，我们无法确定患者症状和肠道菌群的变化是来自FMT还是代表疾病的自然过程。对人类的深入研究将来可能更可靠地回答FMT的机制。当前基于洗涤菌群移植(WMT)的疗效和安全性可能与基于手动制备的FMT的研究不同[31]。但是，没有针对CRE的金标准治疗方法。各种治疗方法包括药物，内窥镜治疗，高压氧治疗和外科手术在内的价值有限。本研究显示了CRE的新治疗选择。
总之，本病例系列首次证明，FMT是可以安全和有效地在一段时间内改善CRE患者的肠道症状和粘膜损伤。FMT作为CRE治疗的疗效需要在随机、安慰剂对照试验中确定。
声明
伦理学的批准和同意参与
涉及人类参与者的研究中执行的所有程序均符合机构和/或国家研究委员会的道德标准，并符合年的《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的道德标准。该研究得到南京医院伦理审查委员会的批准。该试验已在
